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真相还是假象?神经所杨辉CELL论文再遭质疑

知识分子  · ZhiHu-Article  · 科学  · 2021-04-01 13:52

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导 读

2020年4月,中国科学院神经科学研究所研究员杨辉课题组在Cell 上发表研究论文。2020年7月,美国加州大学付向东教授举报杨辉“ “剽窃和涉嫌造假等学术道德不端行为”。造成中国国内学术界轩然大波。一波未平,一波又起,2021年2月1日,美国哈佛大学、霍普金斯大学等校教授(包括美国科学院院士)公开发表文章,提出多种质疑。海内外神经科学家在本文发表公开意见。


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撰文|邸利会


2020年7月,一封举报信在网上流出。加州大学圣地亚哥分校细胞和分子医学系教授付向东实名向中科院、科技部、基金委举报中科院神经所研究员杨辉,称其有 “剽窃和涉嫌造假等学术道德不端行为”。被质疑的杨辉的论文于2020年4月30日发表在Cell上。


此后,付向东向《知识分子》确认,在与神经所沟通,希望提供DNA引物订单证据无果后,确实投递了这封举报信。尽管杨辉也通过其他媒介作出了回应,但付向东却认为 “明显避重就轻、文过饰非”。言外之意,没有正面回应他的质疑。


数月过后,当两人的争议渐趋平静时,神经再生领域的多位专家却依然发表文章,怀疑杨辉的那篇Cell 论文中看到的可能是假象,部分结论需要独立的重复检验。


那么,疑点在哪呢?


01 直接的 “矛盾”

视网膜的分层结构和不同的细胞类型,图中红色的为视锥细胞,蓝色为视杆细胞,棕色为视网膜神经节细胞,紫色的为视网膜主要的胶质细胞之一穆勒(Müller)细胞。图源维基百科https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Retina_layers.svg


在最常见的三种视网膜疾病中,老年黄斑变性、糖尿病性视网膜病变会导致作为光感受器的视杆和视锥细胞丧失;青光眼会导致视网膜神经节细胞丢失。这三种视网膜神经元的丢失造成了大部分不可逆转的眼盲。单在美国,这三种疾病共折磨了近1500万人,并且随着人口老龄化,其患病率也在增加。


那么,如果有疗法可以让这些丢失的视网膜神经元再生,就有很重要的临床意义。


2020年4月,澳门科技大学教授张康和付向东等合作发表文章,在敲低视网膜胶质细胞穆勒(Müller)细胞的某种蛋白质PTBP1的表达后,发现穆勒细胞转变成了视锥细胞,且视锥参与的光反应显著恢复。


紧接着4月30日发表的杨辉Cell 论文,用了不同的技术手段,同样敲低了穆勒细胞中同一个PTBP1的表达,却将穆勒细胞转化为了视网膜神经节细胞。


2021年2月1日出版的The Journal of Clinical Investigation 上,发表了约翰霍普金斯大学教授 Seth Blackshaw 和哈佛大学教授 Josh Sanes 的观点文章(以下简称JCI文),二人在考察了最近出现的一些看起来很 “给力” 的研究后,发现不少矛盾之处,其中就涉及到上述两篇研究,作者指出——


都是一样敲低了视网膜穆勒细胞中PTBP1的表达,穆勒细胞却转化成了不同类型的神经元——一个是视锥细胞,一个是视网膜神经节细胞,这种不同需要解释。


Blackshaw和Sanes都是研究视觉系统发育、损伤和再生的资深专家,后者是美国科学院院士。


事实上,除了JCI文指出的这点不同,付向东于2020年6月24日发表的Nature 论文的部分结论和杨辉这篇Cell 论文更有着直接的矛盾。


比如,付向东是通过RNA干扰技术降低PTBP1基因表达,在帕金森小鼠中脑的黑质致密部,把星型胶质细胞转变成了多巴胺能神经元,并进一步投射到纹状体。


而杨辉则是通过基因编辑技术,敲低PTBP1基因表达,直接在帕金森小鼠脑中的纹状体区域,把星型胶质细胞转变成了多巴胺能神经元。


然而,除了在中脑外,付向东还在其它脑区多做了些验证,结果发现,在小鼠纹状体星形胶质细胞中敲降PTBP1并不能够再生出多巴胺能神经元。


这与杨辉的结论直接冲突。


“纹状体里95%都是GABAergic神经元,所有有转分化的文章得到的都是这类的神经元,只有加了多巴胺能神经元特有的因子才能得到一定量的多巴胺能神经元。有经验的人一眼就能看出杨辉的细胞都是些死细胞。大家都知道抗体很容易附着在死细胞上,因而得出不合常理的结论。” 付向东向《知识分子》表示。


杨辉的结果也让另外一些神经科学家感到惊讶。


“纹状体内的神经元主要都是GABAergic的(神经元),在这样的微环境下,纹状体的胶质细胞理论上变成GABAergic神经元的可能性会比较大。如果要变成多巴胺神经元,我想应该需要一些特定的因子来推动。” 暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院教授陈功告诉《知识分子》。


他还进一步表示, 如果在纹状体里再生了多巴胺神经元,应该深入了解这些本来不存在的、突然出现的多巴胺神经元,是否可能会对纹状体的局部神经环路、乃至更广泛的大脑神经环路产生不良影响。


02 “疯长” 的轴突?


除了这些直接的矛盾,杨辉的论文还有其他令人惊讶的地方。


在他的论文中,不仅穆勒细胞转化为了视网膜神经节细胞,且新生的细胞轴突也能够迅速通过视神经投射到外侧膝状体核(LGN)和上丘(SC)并修复了模型动物损伤的视觉功能。


JCI文的作者提醒到,成年哺乳动物视网膜当中的轴突化的视网膜神经节细胞的再生效率是比较低的,且再生轴突的数量也是很有限的,也很少会达到中央目标(central targets)。


杨辉Cell论文截图,视网膜神经节细胞轴突通过视神经,把视觉信号传递到视网膜外面,到达脑的外侧膝状体核(LGN)和上丘(SC)区域。


“轴突生长和其它中间状态相比,时间更长,应该比较容易观察并记录下来。对长距离轴突投射神经元来说,产生新的神经元只是功能恢复的第一步,后期轴突生长,导向,突触形成,和髓鞘形成每一步都必不可少。” 约翰霍普金斯大学医学院教授周峰泉告诉《知识分子》,在轴突再生领域,如何在成年动物神经系统中(缺少许多发育过程中的导向因子和支持的外部环境)正确导向再生的轴突回到原来的靶点仍然是一个难题。


而在2020年12月发表在 The FEBS Journal 的综述文章中,周峰泉认为,杨辉论文中新产生的视网膜神经节细胞的轴突生长太快了,数量也太多了,他在论文中具体阐述道——


“在两周内,杨辉研究新产生的视网膜神经节细胞的轴突就从外核层(ONL)一直长到中脑的上丘,每周生长7.5毫米,而大多数的轴突再生研究,四周后才达到视交叉,每周只长1毫米,且到了视交叉的大多数再生轴突都找不到目标脑核的路途;此外,在另外一项遵循细胞移植策略的研究中,在所有移植的具有高度再生能力的P0小鼠视网膜神经节细胞中,只有极少数能实现轴突再生,那些确实能延伸出轴突的,在视网膜神经节细胞层移植3周后,只有非常有限的视网膜神经节细胞把轴突延伸至了视网膜视神经的出口,离视交叉和上丘还差很远。”


付向东则认为,杨辉的工作认为视神经可以以正常发育十倍的速度生长,“完全违背科学常识。”


03 看到的是假象?


这些相互矛盾、甚至有反常识的现象如何解释?胶质细胞到底是不是真的转化成了神经元?


在考察了当前涌现的诸多神经原位再生的研究后,JCI文的两位作者、周峰泉等业内不少专家都意识到,要排除假象,需要做更多的检验以完善证据链条。


JCI文中作者罗列了三种可能的“假象”,图B认为胶质细胞也许没有转变成新神经元。图片来自参考文献1论文截图。


首要面对的是 “泄漏” 的问题。


我们的大脑,比如视网膜,主要有两类细胞,神经元和胶质细胞。这些实验总的目标是把部分胶质细胞变成神经元,流行的方法是用病毒把某种工具包(包括启动子)专一性的递送到胶质细胞里进行干预(比如过表达或者敲除某个基因),为了跟踪这些胶质细胞,工具包里也会带荧光蛋白基因。这样,原则上就可以看哪些胶质细胞真的变成了神经元。


但理想和现实存在差距,实际中,某些工具包的设计并不能保证仅仅对胶质细胞进行操作或标记。


”这个意思就是,你以为你设计的反应是应该百分百在胶质细胞里面进行的,但实际上不完全是,而且当你用的病毒滴度越高,这种反应越可能会在神经元里面进行,所以如果你使用了过量的病毒,就有可能直接在神经元里面看到原本应该在胶质细胞里表达的荧光蛋白,这样你以为看到了转变后的新神经元,但也许只是原来的神经元。” 陈功解释说。


就泄漏而言,周峰泉认为,杨辉等人实验中用的AAV病毒、GFAP启动子,特异性都成问题。


“首先使用的AAV病毒本身就会感染视网膜内的不同种类细胞,包括神经节细胞(RGCs)和胶质细胞(如穆勒细胞)。同时,特异性针对穆勒胶质细胞进行基因编辑主要是通过使用GFAP胶质细胞特异性启动子,但GFAP启动子胶质细胞特异性并不是100%可靠。含GFAP启动子的基因也可能在神经元细胞里表达。” 他说。


不过,陈功也提醒,泄漏的存在并不应该把胶质细胞转分化为神经元的可能性彻底否定掉。


在具体实践中,他的团队和国际上许多其他团队曾使用逆转录病毒来证明胶质细胞的转分化,原因是逆转录病毒只会针对分裂型的胶质细胞,不会泄漏到不分裂的神经元里。他的团队还运用胶质细胞谱系示踪小鼠证明了事先标记示踪的胶质细胞确实可以转化为神经元。


“所以,一定要全面客观地评价原位神经再生这一新技术,不能因为有人做错了实验就把整个领域一棍子打死。” 他说。


作为该领域的先行者,陈功也曾发表文章对一些评论进行了澄清。在他看来,AAV 虽然有泄漏现象,但是只要把滴度降的比较低,是可以把泄漏比例降的很低——


“我们通常推荐用1x108-10GC/ml的滴度把假阳性的比例降到5%或者更低。有些实验室使用了过高量的AAV,比如超过1x1013GC/ml的滴度,这种高滴度所造成的假阳性值得关切。有些实验结果需要第三方验证。”


然而,奇怪的是,尽管杨辉的Cell论文使用的不同AAV都是1013的 “高” 滴度,竟然没有观察到任何的泄漏。


04 缺少的中间状态?


另外一个说明确实发生了转化的方法是证明中间态的存在。


试想一下,胶质细胞转变成神经细胞不可能是瞬间发生的,一定经历了某种中间过程和状态——细胞的形态可能发生变化,细胞的位置正逐步迁移,细胞内部分子和功能也逐步变化。


而在之前的举报信中,付向东曾指出杨辉Cell 论文缺乏转变的中间状态——


“杨辉的这篇《细胞》论文在4月份在线发表后,许多神经生物学领域的专家随即对其数据的质量和可靠性提出了一系列质疑,指出论文并没有确凿的证据证明诱导新产生的神经元细胞所必经的细胞迁移、渐近的细胞形态和基因表达转变以及新获得的神经电生理特性等等。通俗地说,由于没有细胞转分化过程的系列实验数据的支持,很难说他们的结论真实可靠,不能排除他们看到的阳性结果是出于实验室常见的实验假象。”


付向东认为,支持杨辉结论的大多数证据, 很有可能是由于GFAP-CRE在内源神经元中的泄漏表达所致。


胶质细胞向神经元转变的过程伴随着形态、转录组、位置的迁移变化。(图片来自参考文献2论文截图)


那么,如何做才能让人信服?


“就好像一个人坐电梯从10楼下到1楼,总要一层层下,不会一下子就跳到一楼了。我们团队在小鼠和猕猴的大脑皮层里,都观察到了星型胶质细胞向神经元转化的中间态,也就是转化早期的细胞既有部分胶质细胞的属性又有神经元的部分属性,这种中间态的存在是细胞之间转分化的强有力的证据,” 陈功解释说。


周峰泉也建议,应尽可能密集地捕捉转变的中间状态——


比如,视网膜中穆勒胶质细胞和视网膜神经节细胞分布在不同的层,转变意味着,穆勒胶质细胞要一步步 “爬” 到目的地,且细胞形态和转录组要经历逐步的变化(单细胞测序可以用于做这样的分析);最终,新转变成的视网膜神经节细胞,需要进一步追踪其轴突生长,准确的投射到相应的脑区并发挥正常功能(当前脑组织清洗和深度3D影像技术都可以做这样的观察)。


05 需要重复


质疑和批评是科学的常态,也是进步的源泉,尤其是在面对纷繁复杂的新兴领域的时候。很多时候,区分事实和假象并不容易,但“如实报告”是应有的基本规范和底线。


尽管有各种可供批评之处,不少研究都声称缓解或者治疗了动物模型的某种神经疾病。显然,基础研究的结果越可靠,就越有利于后期的临床转化。杨辉等人报道的 “诱人” 结果,无论是治疗神经性眼盲还是帕金森,引发更大范围的关注自然也不奇怪,如果是一项不重要的结果,也很少会有人争抢。


同样也面临JCI一文质疑的张康向《知识分子》表示,“选择四月龄甚至更大的rd10小鼠,已经检测不到感光细胞和视网膜电图信号,再结合GFAP-CRE追踪系统,我们认为后形成的感光细胞和功能由穆勒胶质细胞转化而来”。


他也同时承认,后期需要完善体内追踪系统,包括使用更长或全长GFAP启动子、double cre,设置严格的对照组,足够密集的取样时间点和全面的分析手段,逐级追踪穆勒胶质细胞向神经细胞的转化过程,对形成的细胞进行全面的分析,以证明所看到的神经细胞真的由穆勒胶质细胞而来。


付向东就此也向《知识分子》表示,对于JCI文质疑,他们正设计实验全面解决AAV泄漏的问题。


截止发稿时,杨辉没有回应《知识分子》的电邮询问。


“我相信如此拉风的研究一定会有人重复,只有重复才能做出最终的判断。” 陈功说。


参考资料:

1. 付向东首次回应:与神经所杨辉论文争议始末,zhishifenzi.com/column/

2. Seth Blackshaw, Joshua R. Sanes. Turning lead into gold: reprogramming retinal cells to cure blindness. J Clin Invest. 2021;131(3):e146134. doi.org/10.1172/JCI1461.

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