RNAseq基础（项目设计，方法原理）

一、项目设计

1. 测多少数据量？
2. 几个生物学重复？
3. 混池测序是否性价比很高？
4. 参考序列怎么选？

二、分析方法

1. 转录本拼接
2. 比对的两种模式
3. 表达定量
4. FPKM，RPKM，TPM，TMM
5. 差异表达分析

1. 什么是基因组？

物种、亚种、个体、单细胞都可以测基因组。基因组是指一个细胞或者一个生物的完整序列，包括基因序列和基因间区域序列。在实际研究中，一个物种内的基因组差别不大，常说的是指物种的基因组，即参考基因组。
对于二倍体来说，两套染色体差异较小，常说的基因组是指单倍体的基因组，再加上差异较大的性染色体。

2. 转录组的研究对象

主要研究 mRNA ，但是生物体内 mRNA 只占一小部分（1%-5%） ，所以实验中应当提前去除其他RNA保留 mRNA。

mRNA 有编码蛋白质的能力，它又被称为编码 RNA 。而其他没有编码蛋白质能力的 RNA 则被称为非编码 RNA（ncRNA）。它们经由催化生化反应，或透过调控或参与基因表达过程发挥相应的生理功能。比如:
tRNA（转运RNA）在翻译过程中起转运RNA的作用
rRNA（核糖体RNA）于翻译过程中起催化肽链形成的作用
sRNA（英语：small RNA）（小RNA）起到调控基因表达的作用,比如组成剪接体的 snRNA ，负责 rRNA 成型的 snoRNA ，以及参与RNAi作用 的 miRNA 与 siRNA 等，可调节基因表达。

3. 转录组研究前提

相同基因在不同组织中表达不同
相同基因在同一组织中不同条件和时间中表达不同
因此，研究的转录组是指，某组织/细胞在特定条件下基因的转录情况。

4. 转录组测序流程理解

贴一个知乎专栏回答
https://zhuanlan.zhihu.com/p/139773946

5. 如何评价自己的测序结果和分析结果？

比如：

• 10个生物学重复和3个生物学重复对于差异基因的表达有多大的提升？
• 哪个差异表达鉴定软件更加准确？

引入以下指标， 准确率、召回率、PRC、F-measure

这里精确率的计算方式，把正确的加起来除以总的，这里 A 捞上来的700条鲤鱼和 D没有捞上来的虾和鳖是正确的。（因为我们只想捞出来鱼不想要虾、鳖，没捞上来的鱼不应该，捞上来的虾鳖也不应该）
但是这样会有问题，如下

如果只预测人都健康，那么这个精确率会很高，但是不符合实际。所以，需要引进更专业的数据。

这里会发现，准确率和召回率很难平衡，就像渔网网孔的大小一样，所以就又引入了一个指标，F-measure。

另外一组评价体系和指标， 敏感度、特异度、ROC、AUC

然后根据真阳性率和假阳性率作图，线条偏左上方的最好，如果难以判断就计算线条右下方的面积（AUC），面积越大说明真阳越多，假阳越少结果就越准确。

6. 转录组分析整体流程

1. 提取 smallRNA或者 mRNA(最常用来研究的RNA)
2. 随机打断
3. 逆转录成 cDNA
4. 测序

有参考基因组的转录组

5. 比对到参考基因组上计算表达量

   
   
   有参考基因组

无参考基因组的转录组

5. 先整合测序结果，组装一个参考序列，再进行比对计算计算基因表达量

   
   
   无参考基因组

有参考基因组的可以额外多做一些东西，如：

7. 转录组项目设置

• 取哪些样品？
  根据自己的实验设计来取样。

• 设置几个重复？

  
  

• 多少数据量？
  
  
  
  
  可以看出重复越多，测序量越大结果会越好。
  测序深度建议

8. 混池测序

在探究差异表达基因的时候不能混池测序，如果实在想混池，样本一定要多，80，100+，大量样本的混池，如果仅是对序列进行研究那么可以混池测序

9. Trinity 拼接原理

Inchworm Algorithm（将 reads 打断成 k-mer，通过 K-mer 算法构建线性序列）

使用这种方法拼出序列

同时为寻找可变剪切提供条件

Chrysalis（根据线性序列 k-1mer 的重叠关系进行组合，构建可变剪切的关系（德布鲁因图）一个图对应一个基因，不同的路径代表不同的剪接形式）

Butterfly（根据 reads 对各个路径的支持，选择最优路径，打印出最终的序列）

10. 比对到参考序列

11. RPKM FPKM TPM

RNA-Seq 数据的定量之RPKM和FPKM
RNA-Seq 数据的定量基本假设以及TPM

12. 样品间表达标准化

鉴定样品间基因的差异表达时，我们往往关心的是绝对表达量是否有差异，因此需要对组间的数据进一步标准化。如图：

此处显然由于 G5 基因表达过高，导致其他基因相对表达降低。

解决方法1：
内参基因（管家基因，看家基因）：不同组织、不同条件下表达恒定的基因。

但是，看家基因数量不多，对于无参考基因组的物种来说也不现实，比较依赖基因注释结果。所以不太提倡使用。

解决方法2 ：
假设大多数基因都是没有差异表达的

image.png

实际操作中，trinity里面有相应的 run_DE_analysis.pl 脚本可以使用

13. 利用假设检验进行差异表达基因的鉴定