在开头的两期我们介绍了 illumina 公司的二代测序技术以及 HiSeq 测序仪，不知道大家是否被其工程师高超的智商和解决方案所折服呢~接下来我们也会陆续介绍其他厂商的各种测序方案。
「本期先让我们一同了解 PacBio 公司的三代测序技术吧~」
目录
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第三期原视频（可关注文末公众号观看）
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SMRT 技术
SMRT™ Cell
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测序流程
哑铃状文库
测序
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单分子测序
读长限制因素
数据通量
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其他应用
甲基化判定
GC Bias
视频讲述内容基于当时的RSII平台，本文将结合当下的Sequel平台进行介绍。
SMRT 技术
SMRT™，全称「Single Molecular Real Time Sequencing」，中文可译为单分子实时测序技术[1]，是一项基于第二代 SBS 测序技术研发的第三代测序技术。第三代测序除了延续对高通量测序技术的应用，更着重于对单分子核酸的测序，其中Sequel平台的平均读长可超 10kb。
SMRT™ Cell
与第一期一样，我们先从测序芯片开始介绍。这是一张厚度为 100nm 的芯片，有效面积如人拇指指甲盖大小，一面带有 15 万个直径为几十纳米的纳米孔，称为 ZMW。一张芯片上的有效纳米孔能同时进行测序，一次就可得几亿个碱基序列。
ZMW
看到这张图是不是感到似曾相识呢？当然这不是 illumina 的 NanoCell，其中的纳米孔是 PacBio 的 ZMW，全称「Zero Mode Waveguide」，中文可译为零模波导管。其命名是由于纳米孔底部具有特殊的光学设计，激发光在纳米孔中衰减极快，只有在距底部 30nm 范围内的 dNTP 才能被激光出荧光信号，从而降低了测序的荧光背景噪音，有效提高测序的准确度。
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其光学设计可以简单且不严谨地用「波粒二象性」做出解释。
虽然同样基于 SBS 技术开发，但与 illumina 将荧光基团标记于碱基上不同，
PacBio 对 dNTP 的处理是将荧光基团标记在 3’端的磷酸基团末端。
这样做有两个好处，既减短时间，又能延长读长：
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当 dNTP 与 DNA 链聚合时，荧光基团就会随 PPI 一同被切掉，随溶液漂走，省去单独切去荧光基团的过程。
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减少 DNA 合成的空间位阻，有效延长读长，而且能最大限度地保持天然聚合酶的活性，无需对其再加以人工改造。
在RSII平台的实际测序中，每个托盘有 张 SMRT™ Cell，配合相关机器可以大幅提高测序的自动化程度。
测序流程
哑铃状文库
PacBio 的建库也是比较特别的。再将 DNA 打碎补齐后，其加上的接头是发夹状的接头序列（如图蓝色序列），最后形成哑铃状的 DNA 文库。
显而易见，这样整个 DNA 分子就是一个圆环，也就是说，聚合酶可以周而复始地进行测序，有利于 PacBio 发挥其读长的优势，通过重复测序，也能提高其测序准确度。
测序
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聚合酶和文库被固定在 ZMW 的底部。
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其固定方式为
「生物素－亲和素系统」
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在聚合酶上标上生物素，在纳米孔的玻璃底板上标上链霉亲合素，利用生物素和链霉亲合素的亲合力，将两者紧密结合。
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加入荧光标记的 dNTP 底物。
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符合碱基配对原则的 dNTP 会聚合到新生成的 DNA 链上。
这时激发光使 dNTP 发出荧光信号，通过对荧光信号可以判读四种碱基，通过感光原件输入到电脑。
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自然状态下，聚合酶每秒能合成约1k 碱基对。
为了能让电脑捕捉，这里使用的聚合酶反应速率必须足够慢，每秒能合成约三个碱基。
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随着新一轮碱基配对，荧光基团被切断漂走。
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循环往复，完成测序。
（需时约 3 小时）
测序速率
由于 PacBio 使用 SBS 技术，以每秒合成（即测序）三个碱基计算，要达到其最大读长需要三个小时左右。也就是说跑一个 Run 只需要三个小时，比 illumina 按天数计算的测序速率和另一家测序设备公司 Ion Torrent 约 5h 的测序速率都要快。
单分子测序
可以说，单分子测序是 PacBio 超长读长的优势来源。
上一期我们谈到，在 illumina 通过 PCR 扩增测序一簇分子时，总会出现 Phasing & Prephasing。随着读长变长，其带来的噪音也会越来越大，直至掩盖掉正常的测序信号。
那要如何解决这个问题呢？illumina 一直在尝试各种生化及计算机手段减缓 Phasing & Prephasing 的影响，而 PacBio 的做法就更为简单——不进行 PCR 扩增，只测序单个核酸分子。由于不存在同步的问题，单从这方面看，其读长理论上可以做到无限长。
读长限制因素
当然以上说法在现实中是不存在的，现实中有很多因素制约着其测序的实际读长，以下为主要的因素。
激发光
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强光
长时间
照射 DNA 可能会使环形 DNA 链断开，从而使测序终止。
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强光也可能使酶变性，使其失去应有功能，导致聚合速率加快或测序终止。
建库
以现有建库方式，即使是自动化操作，要制作长度超过 30Kb 的文库有一定的技术难度。
碱基判读不准
PacBio 最大的缺点就是对碱基判读的错误率高达 12.5%，也就是说，它每读 8 个碱基，就有一个是读错的。
它主要的错误类型是插入，即它会多读一个碱基。不难想到，在同聚物区段（一连串的相同碱基）进行测序时，错误率会更高。
这是其生化方法中产生的随机错误，随着测序深度增加，这些偶然误差可以在统计学上被校正成正确序列。
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虽然可以通过统计学校正序列，但是这也为其带来一个致命缺点：
「计算机无法区分单次测序错误和罕见的基因突变。」
数据通量
当时，一个 SMRT 芯片可以给出约 5 万条有效 reads，并得到约 0.4G 的有效数据量。可以说，通量是 PacBio 目前的死穴。
限制因素
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纳米孔数量及上样质量。
虽然目前的芯片能做到 15 万个纳米孔，但并非每个孔都能产生有效数据。在上样过程中，
「聚合酶、引物、模板」
组成的测序复合物被随机铺撒到这 15 万个纳米孔，过程符合泊松分布。
也就是即使在最理想的情况下，只是有1/3的纳米孔是正好有一个测序复合物，另外有1/3的纳米孔是多克隆， 的纳米孔没有接收到复合物。
空的纳米孔不会产生信号；多克隆的纳米孔产生的信号非常杂乱，所以只有1/3的单克隆纳米孔才能产生有效的数据——5 万个有效孔乘以 10kb 平均读长，算上损耗就是 0.4G 的有效数据量。
除了增加纳米孔数量，还可以通过优化上样流程，增加出现单克隆纳米孔的概率。
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聚合酶延伸性和碱基配对准确率。
目前，在 P6C4 试剂下，大约每 SMRT™ Cell 已经可以做到 0.6G ～ 1G 有效数据量，个别用户能达到 2G。
其他应用
甲基化判定
当聚合酶，遇到模板上有甲基化的 A、C 等碱基时，它测序的速度会明显地放慢，而且其光谱特征会发生改变。再通过相应的机器学习算法，就可以判断，这个位置上的 DNA 是否被甲基化。
GC Bias
在 PCR 过程中，遇到 G、C 碱基时，PCR 的效率会降低，由此导致的当 G、C 含量偏高的序列时产生的 reads 数偏少，这种现象称为
「GC Bias」
。
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其原理可以通过 G、C 配对形成三条氢键做解释。
而由于 PacBio 测序没有 PCR 过程，在序列中高 GC 的片段和低 GC 的片段有差不多的概率被读到。通过 SMRT 测序就可以轻松测序富含 AT 或 GC 的区域、高度重复的序列、长同聚物和回文序列。
以上是本期文章全部内容，如需更详细了解 PacBio 测序背后的生化原理和工作流程可登录PacBio 官方网站[2] ，再次感谢各位读者的支持！
References
[1]Eid, J., Fehr, A., Gray, J., Luong, K., Lyle, J., Otto, G., ... & Bibillo, A. (2009). Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 323(5910), 133-138.:
http://dx.doi.org/10.1126/science.1162986
[2]SMRT SEQUENCING - PacBio:
https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/
