PBJ | 湖北大学杨秋颖课题组开发基于微同源重组的植物DNA病毒侵染性克隆稳定构建系统

主要观点总结

近日，Plant Biotechnology Journal发表了由湖北大学杨秋颖课题组及其合作团队撰写的论文，关注植物双生病毒的农杆菌侵染性克隆中质粒DNA的不稳定现象。该研究解析了环形单链DNA病毒侵染性克隆不稳定的分子机制，并设计了基于微同源重组修复（Microhomology-mediated end joining, MMEJ）的侵染性质粒构建方法，解决了DNA病毒侵染性载体在农杆菌中不稳定的问题。论文介绍了工作的主要研究结果。

关键观点总结

关键观点1: 发现双生病毒TYLCCNV侵染性克隆中病毒复制相关蛋白在农杆菌中的异常表达导致侵染性载体质粒不稳定，人工侵染克隆的活性逐渐减弱，侵染植株发病弱甚至不发病。

为了解决这一问题，研究者在病毒复制相关蛋白编码区内插入限制性内切酶I-Sce I的识别位点，破坏病毒复制相关蛋白在农杆菌中的异常表达，达到稳定病毒侵染性克隆的效果。并在侵染植物时通过微同源重组修复机制无缝去除引入的序列，产生活性病毒侵染性克隆。

关键观点2: 研究揭示了侵染性克隆不稳定的机制，并构建了简化的pY10A模型克隆进行研究。发现病毒复制相关蛋白（Rep）是病毒侵染性克隆不稳定的关键因素。

为了验证这一发现，研究者构建了含有DSB/SSB的双拷贝串联重复模型，并验证了人工双链断裂并不导致侵染性克隆模型中串联重复单元缺失。这些结果表明侵染性克隆不稳定是由Rep从ori起始的滚环复制直接导致。

关键观点3: 为了解决植物双生病毒的农杆菌侵染性克隆中质粒DNA的不稳定问题，研究者首创了基于MMEJ修复的侵染性质粒构建方法。这种方法保证了原核工程菌中侵染性克隆稳定的同时能够达到高效的植物侵染效果。

该研究为有潜在不稳定性的植物DNA病毒侵染性克隆的构建提供了明确的稳定构建设计方法，为植物DNA病毒的深入研究以及其作为外源基因过表达和沉默工具的应用提供了基础。